W czasie II wojny światowej, pomimo licznych trudności i represji spowodowanych polityką okupanta: osadzenia sióstr w obozach koncentracyjnym (4 w Oświęcimiu) oraz zamykania domów zakonnych w części wcielonej do Rzeszy, jeżeli było to możliwe, służebniczki nie przerwały swojej pracy (na terenach pod okupacją radziecką znalazły się 134 placówki, w Generalnej Guberni - 162, na Górnym Śląsku 19 i w „Kraju Warty” 24). Najtrudniejsza sytuacja panowała na terenie „Kraju Warty”: siostry wywiezione zostały do obozu pracy w Bojanowie, niektóre nielegalnie przekroczyły granicę Generalnej Guberni, natomiast część pozostała w rozproszeniu. Podobnie jak w latach I wojny, siostry rozszerzyły zakres prac, zwłaszcza na polu charytatywnym: niosły pomoc chorym, ubogim, więźniom, uchodźcom, Izraelitom (między innymi przyjmowały dzieci kierowane do sierocińców przez Radę Pomocy Żydom), w Krasnymstawie i Lublinie prowadziły rejestrowane pracownie dla młodzieży, chroniąc ją przed wywiezieniem do Niemiec, aktywnie współpracowały z lokalnymi strukturami Rady Głównej Opiekuńczej - Polskimi Komitetami Opieki Społecznej oraz Polskim Czerwonym Krzyżem. Prowadziły 124 punkty dożywiania. Z narażeniem życia jako nauczycielki prowadziły w szkołach tajne nauczanie. Pracowały wśród rannych żołnierzy w szpitalach polowych i na liniach frontu. Same także dzieliły los uciekinierów, wysiedlonych i repatriantów. We wspomnianym okresie zgromadzenie poniosło znaczne straty. Wzrosła śmiertelność na skutek wyczerpania i chorób, osiem sióstr pielęgnujących chorych na tyfus zmarło w wyniku zarażenia się, dwie siostry zginęły z rąk UPA. W gronie zmarłych w latach wojny znalazła się bł. s. Katarzyna Celestyna Faron (+1944 w obozie koncentracyjnym w Oświęcimiu), beatyfikowana w gronie 108 Męczenników II wojny światowej, oraz służebnice Boże: s. Hiacynta Lula (+1943 w obozie w Oświęcimiu) i s. Romualda Grzanka (+1941 w obozie w Bojanowie) oraz s. Leonia Maria Nastał (+1940). Liczba sióstr zmniejszyła się do 1307. Zgromadzenie utraciło w sumie prawie 50% domów, gdyż 120 z nich pozostało poza wschodnią granicą.